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【走進實驗】|分子雜交實驗
時間:2018-06-05 10:57  來源:AG放水时间生物  作者:市場部

  不同的DNA 片段之間,DNA 片段與RNA 片段之間,如果彼此間的核苷酸排列順序互補也可以複性,形成新的。這種按照配對而使不完全互補的兩條相互結合的過程稱為分子雜交。
  基本原理是待測單鏈核酸與已知序列的單鏈核酸(叫做探針)間通過形成可檢出的雙螺旋片段。這種技術可在DNA與DNA,RNA與RNA,或DNA與RNA之間進行,形成DNA-DNA,RNA-RNA或RNA-DNA等不同類型的。
  分子雜交是通過配對之間的非(主要是)結合,從而形成穩定的區。的形成並不要求兩條單鏈的順序完全互補,所以不同來源的核酸單鏈隻要彼此之間有一定程度的互補順序(即某種程度的)就可以形成雜交雙鏈。分子雜交可在DNA與DNA、RNA與RNA或RNA與DNA的二條單鏈之間進行。由於DNA一般都以雙鏈形式存在,因此在進行分子雜交時,應先將雙鏈DNA分子成為單鏈,這一過程稱為變性,一般通過加熱或提高來實現。用分子雜交進行定性或定量分析的最有效方法是將一種核酸單鏈用或非成為探針,再與另一種核酸單鏈進行分子雜交。
 
以下是幾種常見的雜交技術:
 
固相雜交

  將參加反應的一條核酸鏈先固定在固體支持物上,一條反應核酸遊離在溶液中。固體支持物有、、乳膠顆粒、磁珠和等。由於後,未雜交的遊離片段可容易地漂洗除去,膜上留下的雜交物容易檢測和能防止靶DNA自我等優點,所以最為常用。常用的固相雜交類型有:、、狹縫雜交、Southern、、和夾心雜交等。
 
液相雜交

  所參加反應的兩條核酸鏈都遊離在溶液中,一種研究最早且操作複合的雜交類型,在過去的30年裏雖有時被應用,但總不如那樣普遍。主要缺點是雜交後過量的未在溶液中除去較為困難和誤差較高。近幾年由於雜交檢測技術的不斷改進,商業性診斷盒的實際應用,推動了液相的迅速發展。
 
固相膜

菌落原位雜交(Colony in situ hybridization)

  將細菌從轉移到上,然後將濾膜上的裂菌以釋出DNA,再烘幹固定DNA於膜上,與32P標記的探針雜交,檢測信號,並與平板上的菌落對位。

斑點雜交(Dot blotting)

  該方法是將被檢點到膜上,烘烤固定。這種方法耗時短,可做,一張膜上可同時檢測多個樣品。為使點樣準確方便,市售有多種多管吸印儀(manifolds),如MinifoldI和II、Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它們有許多孔,樣品加到孔中,在負壓下就會流到膜上呈斑點狀或狹縫狀,反複衝洗進樣孔,取出膜烤幹或紫外線照射以固定標本,這時的膜就可以進行雜交。

Southern印跡雜交(Southern blotting)

  是研究DNA圖譜的基本技術,在遺傳診斷DNA圖譜分析及PCR產物分析等方麵有重要價值。基本方法是將DNA標本用限製性內切酶消化後,經分離各酶解片段,然後經堿變性,中和,高鹽下通過毛吸作用將DNA從中轉印至(也較常用)上,烘幹固定後即可用於雜交。凝膠中DNA片段的相對位置轉移到濾膜的過程中繼續保持著。附著在濾膜上的DNA與32P標記的探針雜交,利用確定探針互補的每條DNA帶的位置,從而可以確定在眾多酶解產物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

Northern印跡雜交(Northern blotting)

  DNA由Southern於1975年創建,稱為技術。RNA印跡技術正好與DNA相對應,故被稱為Northern,與此原理相似的蛋白質印跡技術則被稱為westernblotting。Northern印跡雜交的RNA吸印與的DNA吸印方法類似,隻是在進樣前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA變性,而不用,因為它會RNA的2’-基團。RNA變性後有利於在轉印過程中與結合,它同樣可在高鹽中進行轉印,但在烘烤前與膜結合得並不牢固,所以在轉印後不能用低鹽緩衝液洗膜,否則RNA會被洗脫。在膠中不能加EB,因它為影響RNA與硝酸纖維素膜的結合,為測定片段大小,可在同一塊膠上加一同電泳,之後將標記物膠切下,上色、照像。樣品膠則進行Northern轉印,標記物膠上色的方法是在暗室中將其浸在含5μg/mlEB的0.1mol/L中10min,在水中就可。在下用拍照時,上色的RNA膠要盡可能少接觸紫外光,若接觸太多或白熾燈下暴露過久,會使RNA信號降低。從中分離功能完整的mRNA時,甲基是一種強力、可逆,但是有毒,因而許多人喜用甲醛作為變性劑。所有操作均應避免的汙染。

組織原位雜交(Tissue in situ hybridization)

  簡稱,指組織或細胞的原位雜交,它與的原位雜交不同,需裂解細菌釋出DNA,然後進行雜交。而原位雜交是經適當處理後,使細胞通透性增加,讓探針進入細胞內與DNA或RNA雜交。因此原位雜交可以確定探針的在胞內的,這一點具有重要的生物學和病理學意義。例如,對致密染色體DNA的原位雜交可用於顯示特定的序列的位置;對分裂期間核DNA的雜交可研究特定序列在內的功能排布;與細胞RNA的雜交可精確分析任何一種RNA在細胞中和組織中的分布。此外,還是顯示細胞亞群分布和動向及病原微生物存在方式和部位的一種重要技術。
  用於原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈DNA,也可以是RNA探針,探針的長度通常以100~400nt為宜,過長則雜交效率減低。2013年研究結果表明,(16~30nt)能自由出入細菌和組織細胞壁,雜交效率明顯高於長探針。因此,寡核苷酸探針和標記的小或標記的RNA探針是的優選探針


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